Az aromás aminosavak átalakítását végző MIO-enzimek szerkezeti vizsgálatait választottuk a projekt témájának. Az enzimcsalád közös jellemzője a fehérjeláncok három aminosavából (általában ASG) kialakuló, a katalízisben elengedhetetlen szerepet játszó 3,5-dihidro-5-metilidén-4H-imidazol-4-on (MIO) csoport jelenléte. A MIO-enzimek közül a hisztidin, tirozin illetve fenilalanin ammónia-liázok [HAL, TAL, PAL] a megfelelő aninosavakból lejátszódó ammónia eliminációt, míg a tirozin illetve fenilalanin 2,3-aminomutázok [TAM ill. (S)-PAM vagy (R)-PAM] a megfelelő α-aminosav β-aminosavvá alakítását katalizálják.

A MIO-enzimek hatókörének nem természetes aromás vagy akár nem-aromás aminosavakra történő kiterjesztését a szerkezet alapú enzimmódosításokat elősegítő molekuláris szintű szerkezeti vizsgálatokkal (fehérje krisztallográfia, SAXS és cryoEM) kívánjuk megalapozni.

A BME ABÉT 3Dstruct laborban végzett röntgenkrisztallográfiai vizsgálatok bíztató előzménye a petrezselyem PAL inhibítorral komplexált szerkezetének megoldása (ld. Ábra), és több további MIO enzim sikeres kristályosítása. Ennak alapján a projekt célja a MIO-enzimek hatásmechanizmusának még részletesebb megismerése szerkezet-alapú tervezett genetikai módosítások elősegítéséhez. A változtatások elősegíthetik a természetes szubsztráttól jelentősen eltérő további szubsztrátok átalakíthatóságának megoldását vagy akár a természtes L-α-aminosavak helyett a D-α-aminosavak szubsztrátként történő elfogadását.

A nagyméretű MIO-enzimek méret- és alakváltozása változó paraméterek (pl. hőmérséklet, pH, ion-erősség, stb.) mellett vizsgálható oldatfázisban kisszögű röntgenszórásos (SAXS) módszerrel, így lehetőség nyílik az enzimaktivitással együtt járó konformáció-változás követésére.

A munka során tervezzük négy MIO-enzimcsalád [PAL, HAL, (S)-PAM, valamint (R)-PAM] illetve további később érdekessé váló MIO enzimek és egyes mutánsaiknak rekombináns előállítását (génszintézisek, klónozás, expresszió optimalizálás, rekombináns expresszió); ezek kristályositási és oldatfázisú kísérleteit inhibítorokkal ill. természetes szubsztrátokkal; a komplexek röntgenkrisztallográfiai, SAXS és cryoEM vizsgálatait, valamint a mechanizmusok vizsgálatát a szerkezeti adatokat felhasználó számítógépes szimulációk (MD, QM/MM számítások) segítségével.

A projektcsapatot a szeniorok mellett számos fiatal tudós alkotja, így a közvetlen eredményeken túl jelentős érték számukra a nemzetközi szintű kutatási ismeretek megszerzése. A kutatás több futó projekthez is kapcsolódik (NKFI SNN, CELSA, NeMSyB).

Poppe László, Bóta Attila, Vértessy Beáta

Konferencia, 2019. november

Eredmény_2020. május

Konferencia, 2021. április