Az extracelluláris vezikuláris protein cargo vizsgálata
Az extracelluláris vezikulák (EV-k) membránnal körülvett, valamennyi sejtünk által termelt képletek, melyek a sejtek közötti kommunikációban betöltött jelentős szerepük miatt új paradigmát képviselnek a biológiában. Molekuláris jellemzőik feltárása izgalmas és úttörő jellegű alapkutatási feladat, miközben diagnosztikus és terápiás felhasználási lehetőségeik feltárása csak most vette kezdetét.
Tervezett munkánk során vizsgálni kívánjuk az EV-k külső és belső fehérje cargo-ját, és annak információtartalmát gyulladásos és daganatos megbetegedésekben.
Korábbi közös MS vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a kanonikus vezikula-fehérjék mellett számos plazmafehérje (pl. albumin, transzferrin, fibrinogén) és immunkomplex-asszociált fehérje (pl. komplement proteinek and immunoglobulinok) is jelen voltak a vezikula preparátumokban. Mindez arra utalt, hogy ezen fehérjék egy része a vezikulák „külső protein cargo”-ját (protein koronáját) képviselik. Mindez alapján felvetődött, hogy i) a vezikuláris külső protein cargo jelentősen módosíthatja a vezikulák sejtekre gyakorolt hatását és ii) diagnosztikus információt is hordozhat gyulladásos és daganatos megbetegedésekben.
1. EV alpopulációkat izolálunk i) humán sejtvonalakból, ii) egészséges kontroll vérplazmából iii) rheumatoid arthritises és iv) pancreas carcinomában szenvedő betegek vérplazmájából. A vezikulák mennyiségét és legfontosabb paramétereit a munkacsoport által rutinszerűen alkalmazott módszerekkel vizsgáljuk (TRPS, tEM, WB, FACS, ELLBA, stb.), majd elvégezzük a vezikulák nano-HPLC/MS(MS) analízisét. Az MS módszert az EV-k vizsgálatára optimizáljuk.
2. A külső vezikula cargo vizsgálatára a vezikula preparátumokat extenzív mosását végezzük el i) fiziológiás sóoldattal, ii) >1M sóoldattal iii) limitált tripszinemésztésel, a vezikulamembrán integritásának folyamatos monitorozása mellett. Elvégezzük az MS adatok összehasonlító elemzését.
3. Extracelluláris vezikula alpopulációkat izolálunk humán sejtvonalak 24 órán át termelt, kondicionált médiumából. Ezeket a „nascens” vezikulákat EV-depletált egészséges, gyulladásos és tumoros betegekből származó vérplazmában inkubáljuk, majd vizsgáljuk a vezikulákkal asszociált fehérjék összetételét MS analízissel.
4. Vizsgáljuk a külső fehérje cargo befolyását az EV-k sejtekre gyakorolt hatása vonatkozásában.
Búzás Edit - Vékey Károly