3. MedInProt konferencia

A konferencia levezetői: Buday László, Málnási-Csizmadia András, Perczel András

9.00 MedInProt méltatása

Dr. Barnabás Beáta Főtitkárhelyettes, MTA

9.10 MedInProt jelentősége az ELTE-n

Szalay Péter rektorhelyettes, Eötvös Loránd Tudományegyetem

9.20 Eredmények, kérdések, gondolatok

Perczel András MedInProt kuratórium elnöke

9.40 TP53 mutációk és az energiaháztartás összekapcsolása emlőtumorban

Ambrus Attila - Győrffy Balázs - Hauser Péter - Tretter László

A rosszindulatú tumorok újabb jellemzői között a kromoszómális instabilitást, az immunválaszt, a gyulladást és az energiaháztartás változásait írták le. Ezek közül az energiaháztartás olyan molekuláris változásokat tartalmaz, amelyek a sejteket az aerob glikolízis irányába tolják el. Kutatásaink során a tumorokban legtöbb mutációt tartalmazó TP53 tumorszuppresszor gén és a metabolizmus kapcsolatát vizsgáltuk. In silico számításokkal és in vitro kísérletekkel bemutattuk, hogy a TP53 mutációja az energiaháztartást több szinten is befolyásolhatja. Eredményeink kiemelik, hogy az egyes kulcsgének mutációs változásához különböző jellemzők szinergisztikus aktiválódása kapcsolódik.

9.50 Daganatos megbetegedésekben jelentős szerepet játszó rendezetlen fehérjék új tisztítási módszereinek kidolgozása
Poppe László - Tantos Ágnes

Együttműködésünk célja új, mágneses nanorészecskékhez (MNP) kötött kelátorok kialakítása és tesztelése rendezetlen fehérjék tisztítása során. A munkánk során több, különböző fizikai tulajdonságú MNP sorozatot készítettünk és teszteltünk le rendezetlen fehérjék tisztítása során. A fehérjetisztítási kísérleteket kiegészítettük az MPN-k fehéreje-fehérje kölcsönhatás vizsgálatokban való használhatóságának vizsgálatával.

10.00 Jelátviteli fehérjék szerepe daganatos sejtek mozgásában

Czirok András - Tímár József

Előállítottunk olyan sejtklónokat a HCA7 vastagbélrák sejtvonalból, amely a KRAS fehérje vadtípusú illetve G12V allélspecifikus mutáns változatát expresszálják. A sejtek mozgását nagysűrűségű tenyészetekben tanulmányoztuk. Előzetes adataink arra utalnak, hogy a mutáns KRAS megváltoztatja a sejtek adhéziós tulajdonságait, ami hozzájárulhat a klinikailag megfigyelt KRAS-mutációhoz köthető szervspecifikus áttétképzési különbségekhez.

10.10 Kalmodulin és az ér-reaktivitásban fontos eNOS és MLCK enzimek kölcsönhatásának szabályozása szfingolipid mediátorokkal
Benyó Zoltán - Liliom Károly

Előzetes eredményeink szerint a szfingozin gátolja az erek tónusának és permeabilitásának szabályozásában kiemelt jelentőségű endotheliális nitrogén-monoxid szintetáz (eNOS) enzim aktivitását, mégpedig azáltal, hogy a kalmodulinhoz (CaM) kötődve gátolja a két fehérje interakcióját, ami az eNOS aktiválódásának alapfeltétele. Munkahipotézisünk szerint a szfingozin és más szfingolipid mediátorok gyulladásos folyamatokban kiváltott érhatásainak egy része a Ca2+-CaM által szabályozott enzimek aktivitásának közvetlen befolyásolásával jön létre. Ezen enzimek közül az eNOS és az érsimaizom kontrakcióját vezérlő miozin könnyűlánc kináz (MLCK) működésének szfingolipidek (szfingozin, szfinganin, C2-ceramid és C16-ceramid) által történő szabályozásának molekuláris mechanizmusait vizsgáltuk a MedInProt projekt keretében. Megmutattuk, hogy a szfingozin ex vivo aorta-szegmenseken is gátolja az eNOS aktivitását, illetve a szfingozin és analógjai gátolják az MLCK enzimet, míg a vizsgált ceramidok hatástalanok.

10.20 Hő- és kémiai denaturáció a humán epesav-kötő fehérjében

Biczók László - Kovács Mihály - Tőke Orsolya

Lokális letekeredési folyamatok fontos szerepet játszanak az intracelluláris lipidkötő fehérjék (iLBP) működésében (zsírszerű anyagok transzportja, nukleáris receptorok transzkripciós aktivitásának szabályozása), és ennek megfelelően számos patológiás állapottal összefüggésbe hozhatók. NMR spektroszkópiai, fluoreszcenciás és kalorimetriás módszerek alkalmazásával jellemeztük a kémiai- és hődenaturációt az iLBP fehérjék családjába tartozó humán epesav-kötő fehérjében. A három különböző technikával nyert termodinamikai, kinetikai és szerkezeti információ összevetése többállapotú folyamatra, valamint a fehérje hidrofób magja és a perifériális N-terminális szegmens eltérő viselkedésére utal.

10.30 – 10.50 Közös kérdésfelvetések

10.50 – 11.30 Kávé szünet/ Poszter beszélgetés (fókusz: Műszervásárlási pályázatok eredményei)

11.30 Fehérjekrisztallográfiai együttműködés az ELTE Kémiai Intézet kristályosító labor és röntgendiffraktométer felhasználásával
Harmat Veronika

Együttműködésünk célja fehérjék és fehérjekomplexek szerkezet-meghatározása a szerkezet, kölcsönhatás-mintázatok és a fehérjefunkció összefüggéseinek felderítése céljából. Kristályosítottuk az aktivált és proenzim MASP-2 peptid inhibitorokkal alkotott komplexeit, az emberi és Plasmodium falciparum kalmodulinnak célpeptiddel alkotott komplexeit, és a sertés acilaminoacil-peptidázt. A diffraktométerrel végzett vizsgálatok nagyban hozzájárultak ahhoz, hogy a szinkroton sugárforrásnál jó minőségű adatkészletet gyűjtöttünk ezekről. Az MTA-TTK kutatócsoportjaival létesített új együttműködések keretében kristályosítottuk a Dj-1 fehérje komplexeit és elkezdtük a DAAO fehérje kristályosítását. Az S100 fehérjék komplexeinek kristályairól röntgendiffrakciós adatgyűjtést végeztünk - a szerkezetek meghatározása segített a komplexet nem tartalmazó kristályformák kiszűrésében.

11.40 A Biostruct laboratórium szerepe makromolekulák, kismolekulák és komplexeik vizsgálatában: egyedi infrastruktúra a fehérjetudomány szolgálatában
Vértessy Beáta

A Biostruct laboratórium egyedülálló infrastruktúrával segíti a molekuláris élettudományok fejlődését: makromolekulák, kismolekulájú ligandumok és ezek komplexeinek háromdimenziós térszerkezetét határozza meg röntgendiffrakciós analízis útján. A laboratórium a házi sugárforrás kapcsán mikrofókuszos sugárforráshoz társított érzékeny detektorral rendelkezik, a vizsgálatok folyékony nitrogénáramban mennek végbe. A kristályosítást automatizált kristályosító robot (Mosquito) és a kristályképződést folyamatosan követő UV-VIS mikroszkópos egység (Formulatrix Rock Imager) segíti. A Medinprot támogatás számos új 3D térszerkezet meghatározását tette lehetővé.

11.50 A kisszögű röntgenszórási módszer fejlesztése fehérjék oldatfázisú mérésére
Bóta Attila

A kisszögű röntgenszórási módszer nanorendszerek, így az oldott állapotú fehérjék szerkezetvizsgálatának hatékony eszköze. Előzőleg egy ilyen berendezést terveztünk és építettünk, amelynek most mintakezelési és mérési adatgyűjtő/feldolgozó környezetét fejlesztettük tovább gyengén szóró fehérje minták esetére. A mintatartó rendszer különböző formáinak (egyedi zárású és átfolyós formák) fejlesztése még folyamatban van.

12.00 Gyors mérések adaptálása és tesztelése
Bodor Andrea

Gyors (SOFAST, BEST) típusú mérések adaptálása és kiértékelése kis koncentrációban jelen levő, vagy bomlékony fehérjék hatékony jellemzésére, illetve in-cell körülmények közötti vizsgálatára. A 2D SOFAST (Band-Selective Optimized-Flip-Angle Short-Transient) HMQC mérések tipikusan 1 perc alatt futtathatók, míg a jelazonosításhoz szükséges 3D BEST (Band-Selective Short Transient) alapú HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, HN(CO)CACB, HNCO, HN(CA)CO pulzusszekvenciák segítségével a korábbi hetes nagyságrend 2-3 napra szűkül. A p53 fehérje rendezetlen TAD régióját használtuk a 3D klasszikus és gyors mérések összehasonlítására, ezen kívül több globuláris és rendezetlen fehérje esetében alkalmaztuk már ezeket a módszereket.

12.10 Fehérje-ligandum és fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálata NMR spektroszkópiával
Tőke Orsolya

Az NMR spektroszkópia a fehérje kölcsönhatások vizsgálatának hatékony eszköze. Előnye, hogy a molekuláris kölcsönhatásoknak mind a szerkezeti, mind a dinamikai aspektusát képes megvilágítani, és az általa nyert atomi-szintű információ összefüggésbe hozható makroszkopikusan mérhető termodinamikai és kinetikai paraméterekkel. A jelen pályázat keretében két rendszert, a neurodegeneratív megbetegedésekkel összefüggésbe hozható alfa-szinuklein, valamint a koleszterinszint szabályozásában szerepet játszó humán epesav-kötő fehérje kölcsönhatásait tanulmányozzuk.

12.20 Lineáris motívumok által dominált fehérje kölcsönhatások felületi plazmon rezonancia-alapú mérése
Pál Gábor

A felületi plazmon rezonancia (Surface Plasmon Resonance, SPR) univerzális lehetőséget biztosít fehérje-komplexek kialakulásának, megszűnésének, szelektivitásának és erősségének valósidejű vizsgálatára.
Az ELTE Természettudományi Kar Központi Kutató és Műszercentruma rendelkezik egy nagy áteresztőképességű ProteOn XPR36 típusú SPR készülékkel, amely ragyogóan alkalmas nagyszámú kölcsönhatásmérés gyors elvégzésre.
A MedinProt támogatásával létrejött, széleskörű együttműködés keretében nagyszámú olyan mérést végeztünk el az LC8 dinein könnyűlánc, a mitogén-aktivált protein kinázok és a metasztázis-asszociált S100A4 fehérjék körében, mely kölcsönhatásokat egy-egy lineáris motívum dominálja.

12.30 Fehérjék poszttranszlációs módosulásainak felderítése nagyfelbontású tandem tömegspektrometria alkalmazásával.
Vékey Károly

A közös kutatómunka célja egy gyulladásos autoimmun betegség, a Rheumatoid arthritis esetén diagnosztikai jelentőséggel bíró fehérjék poszttranszlációs módosításainak vizsgálata. Célunk elsősorban a fehérjecitrullináció és glikoziláció feltérképezése, amelyhez modellpeptideket, enzimkinetikai és tandem tömegspektrometriás méréseket használunk. Az MTA Természettudományi Kutatóközpont rendelkezésére álló nagyfelbontású kvadrupol-repülési idő típusú tandem tömegspektrométer nagy érzékenységet és nagy felbontást kívánó proteomikai méréseket tesz lehetővé, amellyel igen kis anyagmennyiségű minta is analizálható.

12.40 – 13.00 Közös kérdésfelvetések

13.00 – 14.20 Ebéd szünet/ Poszter beszélgetés (fókusz: Szinergia I. és III. pályázatok)

14.20 Fehérje kinázok 4D-ben
Hetényi Csaba - Reményi Attila

Molekuláris dinamikai számítások segítségével atomi szinten feltérképeztük fehérje kinázokból felépülő jelátviteli komplexek atomi szintű mozgásait, valamint az ERK2-RSK1 és Cbk1-Mob2 komplexek kristályszerkezeteire építve bemutattuk a katalitikus komplex, a sejtnövekedési pálya univerzálisan fontos kapcsolóállomása összeépülését. Feltártuk, hogy koaktivátor fehérjék (pl. Mob2) miként szabályozzák az NDR/LATS (pl. Cbk1) kinázok aktivitását. A komplexképződések mechanizmusának finomításához módszereket dolgoztunk ki és validáltunk a fehérjék szabad felszíne, valamint a komplexek interfész régiói hidrátszerkezetének számítására.

14.30 Funkcionális különbségek a humán CR3 (CD11b/CD18) és CR4 (CD11c/CD18) receptorok közt: a CD11b az iC3b-mediált fagocitózisban, míg a CD11c a sejtadhézióban játszik döntő szerepet.
Kellermayer Miklós - Sándor Noémi - Szabó Bálint - Székács Inna

Gyöngy alapú módszerrel meghatároztuk a CD11b és CD11c pontos számát három humán sejttípuson, és azt találtuk, hogy a CD11b/CD11c arány 1.2 az MDDC-ken, 1.7 az MDM-eken és 7.1 a monocitákon, amely arra utal, hogy a CD11c szerepe a MDDC-kben a leghangsúlyosabb, és kevésbé kifejezett a monocitákban. Ellenanyagos blokkolással és RNS csendesítéssel megmutattuk, hogy az (általános CR3- és CR4-kötő) fibrinogénhez való sejtadhéziót a CD11c közvetíti. Ezen felül azt találtuk, hogy a CD11b blokkolása erősíti a fibrinogénhez való sejtadhéziót, amely arra utal, hogy a CD11b és a CD11c verseng ezen ligand kötéséért.

14.40 ALR: kapocs a mitokondriális DNS és oxidatív folding között
Mandl József - Szarka András

A máj regenerációt fokozó (augmenter of liver regeneration, a továbbiakban ALR) fehérje részt vesz a mitokondriális biogenezisben, fenntartásban és a mitokondrium fiziológiás működésében, továbbá a mitokondriális oxidatív fehérje folding apparátus egyik fontos eleme. mtDNS depletált 0 sejtvonalat készítettünk, annak érdekében, hogy megvizsgáljuk a mitokondriális elektrontranszfer lánc és a mtDNS ALR kifejeződésében betöltött szerepét. A mtDNS depléció RNS szinten semmiféle hatást sem gyakorolt, azonban fehérje szinten jelentős mértékben megemelte az ALR kifejeződését. Az ATP és a ROS szintek szabályozásban betöltött szerepét kizártuk, mivel az eredeti sejtvonalakat, légzést gátló- és szétkapcsoló szerekkel kezelve semmiféle ALR expressziós változást sem tapasztaltunk. Megfigyeléseink alapján igen valószínűnek tűnik, hogy az mtDNS és/vagy annak valamely terméke szabályozó szereppel bír az ALR fehérjeszintjére.

14.50 Humán Organikus Anion Transzporter Polipeptidek vizsgálata: új inhibitorok/szubsztrátok azonosítása
Hegedűs Tamás - Laczka Csilla

Az Organikus Anion Transzporter Polipeptid (OATP) család tagjai amellett, hogy részt vesznek a sejtek hormonfelvételében, számos gyógyszert (például tumor- vagy gyulladásellenes szereket) is transzportálnak, ezáltal befolyásolják azok in vivo hatékonyságát. Jelen kutatás keretében elsőkként sikerült kidolgoznunk egy funkcionális esszét a teljes humán OATP család vizsgálatára. Az együttműködésünk eredményeként, az új esszé és bioinformatikai módszerek kombinálásával új potenciális OATP inhibitorokat/szubsztrátokat azonosítottunk.

15.00 A podocin patogenitása, dimerizációja és térszerkezete közötti kapcsolat
Harmat Veronika - Karancsiné Menyhárd Dóra - Tory Kálmán

Kimutattuk, hogy a p.F344Lfs*4 mutáns podocin intracellularis elhelyezkedése endocytosis következménye, ugyanis az endocytosis
gátlását követően megjelenik a sejtmembránban. Ezt a hatást más membrán-asszociált podocinnal való együttes expresszió is biztosítani
tudja, ami arra utal, hogy a podocin-oligomer részeként stabilizálódhat a sejtmembránban. A különböző pontmutációk (A284V, A297V, V290M) és a vad típusú fehérje coiled-coil doménjének stabilitásvizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a mutációk jelentős hőstabilitás-csökkenést okoznak. Ugyanezen mutációk szerkezetre gyakorolt hatásának vizsgálata céljából a megfelelő GST-vel fúzionált fehérjedomének kristályosítási kísérleteit végezzük.

15.10 – 15.30 Közös kérdésfelvetések

15.30 Konferencia zárása / Sorsolás