Diszkerin mutációk in vivo és in vitro jellezése
A diszkerin molekula az eukarióta sejtek egyik legfontosabb RNS modifikációját, a pszeudouridilációt katalizálja, melynek pontos szerepe a sejt működésében nem teljesen tisztázott. Irodalmi adatok sejtetik, hogy a riboszomális RNS-ek pszeudouridilációja a riboszóma működésében lehet elengedhetetlen, így elégtelen pszeudouridiláció a riboszomális komplex működésének zavarát okozhatja, ami klasszikus riboszomopátiás kórtünet formájában jelentkezhet. A riboszomopátiák patogenezise viszonylag ismeretlen terület, így a diszkerin működésének feltárásával fontos ismereteket szerezhetünk ezen a téren.
Munkánk során targetált genomszerkesztéssel zebradánióban létrehoztunk több nullmutációt, illetve hipomorf allélt a dkc1 génben és elkezdtük ezek részletes molekuláris és fenotipikus jellemzését. Ezen munka során bizonyítottuk, hogy a dkc1 hiánya nagyon jellegzetes fejlődési rendellenességeket okoz, amelyek közül számos a sejtek differenciációjának elmaradásával hozható összefüggésbe.
A molekula-komplexek in-vitro nyomásperturbációs fluoreszcencia spektroszkópiai vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a dkc1 egy hipomorf mutációja révén – meglepő módon – erősebb komplexeket alakít ki a partner fehérjékkel, (pl. a NOP10-el) mint a vad típus. A kísérleti adatok analízise majdnem egy nagyságrendi csökkenést mutat a Kd (disszociációs állandó) értékében jelezve ezzel a kötés erősödését, míg ezzel párhuzamosan a kötőfelszín nagysága csökken, amit egyrészt a fluoreszcencia intenztás változásának csökkenése, valamint az aktivációs térfogat csökkenése együttesen mutat. Ebből arra tudunk következtetni, hogy az eddig vizsgált mutációk mindegyike jelentősen átrendezi a komplex összetartásáért felelős kölcsönható felszíneket. Ez az átrendeződés kevesebb, de erősebb kötés kialakítását jelenti, ez egyrészt az interakciók szabályozhatóságát befolyásolja negatívan, másrészt a teljes komplex szerkezetében, és ezáltal a funkciójában okozhat torzulást.
A diszkerint tartalmazó box H/ACA pszeudouridin szintáz komplex által katalizált uridin-pszeudo uridin átalakulás reakciómechanizmusának tisztázásra kvantum kémiai számításokkal vizsgálunk releváns modellrendszereket. Az így azonosított lehetséges mechanizmusokra pontosabb, vegyes kvantum mechanikai/molekulamechanikai számításokat végzünk. A mechanizmus azonosítását támogatják a mutációknak a jelen együttműködés keretében végzett kísérleti vizsgálatai. Ezek a mutációk és a komplex elemeinek kötődése, valamint a pszeudo uridin képződés katalízise közötti összefüggésre adnak információt.
Ferenczy György - Schay Gusztáv - Varga Máté